黄曲霉毒素试剂盒说明书

黄   曲   霉   毒  素  B₁

酶 联 免 疫 检 测 试 剂 盒 使 用 说 明 书

Ⅰ．样品处理方法

1. 食品

1、脂肪含量小的固体样品（如大米、玉米、小米等）称取5.0g样品（已粉碎）于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂将滤液进行稀释（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。

2. 酱油、醋

称取5.0g样品于25ml小烧杯中，用5ml蒸馏水将试样转移到125ml分液漏斗中， 加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

将样品稀释液进行定量或限量测定。

3. 食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等）

称5.0g油样于25ml小烧杯中，用20ml石油醚或正乙烷分次将试样转移至125ml分液漏斗中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，加塞轻轻振摇5min，静置分层，放出下层甲醇水提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释

（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。

4、葡萄酒

      准备称取5.0g葡萄酒于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的的无水Na₂SO₄过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。

5、啤酒、黄酒

      准确吸取5.0ml样品于25ml容量瓶，准确加入12.5ml甲醇，再用蒸馏水定容至25ml。振摇10min，此即为待测样品液。将待测样品稀释液进行定量或限量测定。

      若结果为阳性，则采用葡萄酒中AFB₁的提取方法进行测定。

6、花生

      样品去皮粉碎（刀切或剪切），称取5.0g于100ml具塞三角瓶中。加入25.0ml甲醇水（1+1）和20ml正乙烷（或石油醚），振摇10min，过滤于分液漏斗中，静置分层。放出下层提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：

样品稀释表）。将样品稀释液进行定量过限量测定。

7、月饼、桃酥、花生酱等

      称取10.0g试样于125ml具塞锥形瓶中，加入50.0ml甲醇水（1+1）提取液和20ml正乙烷（或石油醚）加塞震荡15min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一锥形瓶中。准备吸取10.0ml甲醇水提取液（相当2.0g样品）于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。将样品稀释液进行定量或限量测定。

8、面粉

   称取10.0g面粉样于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水（1+1）溶液，震荡15min ,过滤，收集试样滤液。准确吸取10.0ml滤液（相当于2.0g样品）125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷层，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

    将样品稀释液进行定量或限量测定。

   二、  饲料

1、一般饲料及原料

称取5.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振荡15min，过滤，弃去初滤液。收集滤液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将滤液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

    将样品稀释液进行定量或限量测定。

2、饲料浓缩料

称取10.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水（1+1）溶液，振荡15min,过滤，收集试样过滤。

准备吸取10.0ml甲醇水提取液（相当2.0g样品）于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。

放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na₂SO₄过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用A试剂将提取液进行稀释（见表1：样品稀释表）。

    将样品稀释液进行定量或限量测定。

2. 样品稀释表

表1 样品稀释表

Ⅱ.黄曲霉毒素B₁测试盒使用说明书

（定量检测）

  本测试盒利用固相酶联免疫吸附（ELISE）原理，通过抗黄曲霉毒素B₁抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测AFB₁，适用于食品、饲料及相关原料中AFB₁的定量检测，特点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读。

1. 测试盒组成

1、包被抗体的反应板：                         48/24/12孔

2、A试剂：样品稀释液                         1瓶

3、B试剂：AFB₁标准溶液                      1套_{（0.1，0.5，1.5，10ng/ml）}

4、C试剂：酶标抗原                           2/1瓶

5、D试剂：酶标抗原稀释液                     1瓶

6、E试剂：浓缩洗涤液                         1瓶

7、F试剂：显色底物液a                        1瓶

8、G试剂：显色底物液b                        1瓶

9、H试剂：终止液                             1瓶

10、反应板支架：                              1块

2. 实验准备
   1. 样品处理：详见“Ⅰ.样品处理方法”
   2. 试剂的配制

⑴每瓶C试剂中准确加入1.5ml D试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8℃保存。

⑵E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。

3. 实验步骤
   1. 试剂平衡：将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。
   2. 小孔编号：根据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔，2号孔为阴性孔，3-7号孔为AFB₁标准对照孔，其余孔为样品孔。
   3. 洗涤：每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min后

甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。

4、反应物组成：按下列步骤所示，依次加入配制好的溶液及待测样品稀释液。

第一步：1号孔和2号孔分别加入50µl A试剂，3-7号控分别加入系列浓度的B试剂（0.1，0.5，1，5，10ng/ml）50µl,其余孔分别加入相应的样品稀释液。

第二步：1号孔加入50µlD试剂，其余各孔均加入50µlC试剂。

第三步：轻轻地振摇，使各孔的反应物混匀。

                          表2  反应物组成表

5、反应：将反应板放入37℃ 恒温培养箱中孵育30min。

6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍手。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。

7、显色：每孔分别加入显色低物液a（F试剂）和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将反应板放入37℃ 恒温培养箱中显色15min。

8、终止与仪器测定：每孔分别加入终止液（H试剂）50µl，然后用酶测定仪（或黄曲霉毒素B₁专用测定仪）在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。

9、定量测定：

将浓度为0，0.1，1，5，10ng/ml的AFB₁系列标准工作溶液，按上述实验步骤测定相应的吸光度A值，并绘制成标准曲线（见图一）。

横坐标为标准液浓度的常用对数值（1gC），纵坐标为各标准液孔A值与标准液为0ng/ml的A值的比值（A_标准液/A_（0ng/ml））。

计算样品孔A值与A_(0ng/ml)(A_样品/A_(0ng/ml))，查标准线，可得到相应样品稀释浓度（C）的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得样品稀释液的AFB₁浓度C。按下列公式计算出样品中AFB₁的含量：

          AFB₁含量（ng/g）=C×(V/M)×D

式中：C:稀释后样品提取液中AFB₁含量（ng/ml）

V:样品提取液体积（ml）

      M:样品质量（g）

D:样品稀释倍数

四、测试盒贮存

   1、2-8℃贮存，忌0℃以下冻存。

   2、有效期6个月。

五、样品允许量标准请参阅（GB2671-81，GB8381-87）

六、批号：见测试盒

Ⅲ. 黄曲霉毒素B₁测试盒使用说明书

（限量检测）

1. 测试盒组成
   1. 包被抗体的反应板：                                 48/24/12孔
   2. A试剂：样品稀释液                                 1瓶
   3. B试剂：AFB₁标准溶液                       &n